自友康正式發(fā)布GMP級間充質(zhì)干細(xì)胞無血清培養(yǎng)基后，很多老師前來咨詢：

你們的原代分離工藝是否有變化?。?/p>

我怎么養(yǎng)了好幾天還沒有看見細(xì)胞爬出?。?？

我怎樣操作才能分離盡可能多的原代細(xì)胞，做出你們展示的數(shù)據(jù)啊？？？

。。。

莫慌！小編在這里帶著大家梳理一下友康體系臍帶MSC的分離及傳代工藝，本工藝適用于新款及老款的無血清培養(yǎng)基。

1. 將醫(yī)用剪刀、組織鑷、手術(shù)柄、手術(shù)刀等器械提前滅菌。

2. 150mm培養(yǎng)皿或T-175培養(yǎng)瓶。

3. 將5mL培養(yǎng)基因子添加于一瓶500mL培養(yǎng)基中，配制為wan全培養(yǎng)基

1. 用含25mg/L慶大霉素的DPBS清洗臍帶3遍，后用不含慶大霉素的DPBS清洗臍帶至清洗液無血色。

2. 使用醫(yī)用剪刀將臍帶處理成2cm大小的組織段，每段組織沿臍帶靜脈將臍帶剪開。

3. 使用組織鑷撕去臍帶靜脈內(nèi)膜、外皮、兩根動脈使華通氏膠充分暴露。

4. 使用手術(shù)刀將華通氏膠剪切成邊長 3-5mm 的小塊，每2cm組織段切成的華通氏膠小塊接種于一個150mm培養(yǎng)皿中使組織塊均勻分布，添加10mL-15mLwan全培養(yǎng)基。

特別提示：此處組織塊的大小極為關(guān)鍵，組織塊過小不易貼壁，細(xì)胞難以爬出；組織塊過大細(xì)胞爬出時間將延后，3-5mm邊長是友康測試最為合適的大小。

5. 24-48h 后，補(bǔ)充wan全培養(yǎng)基至30mL。

6. 7天全量換液。

7. 10天全量換液。

8. 12-14天收獲原代細(xì)胞。

使用其它表面積培養(yǎng)皿接種量如下：

1. 培養(yǎng)72h后，在顯微鏡下觀察培養(yǎng)的MSC細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到 90%，即可傳代。

特別提示：

細(xì)胞融合度請勿超過100%，特別是切勿使局部過密，導(dǎo)致疊層生長，甚至聚集成球，會導(dǎo)致細(xì)胞嚴(yán)重衰老及分化。再者傳代前細(xì)胞生長過密（細(xì)胞融合度過高），導(dǎo)致細(xì)胞消化異常（細(xì)胞整片或成片脫落），加之隨后的不當(dāng)操作（用移液器反復(fù)吹打成片細(xì)胞使其成為單個細(xì)胞），此操作所導(dǎo)致的機(jī)械損傷會嚴(yán)重?fù)p害細(xì)胞膜，引發(fā)大比例的細(xì)胞死亡，特別是這些細(xì)胞經(jīng)凍存后再次使用時。

2. 在超凈臺中，棄去培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液，加入10 mL PBS清洗細(xì)胞后棄去。

3. 加入3 mL 干細(xì)胞溫和消化酶常溫下消化細(xì)胞。

4. 在顯微鏡下觀察到細(xì)胞全部收縮變圓，且有少量細(xì)胞開始流動時（一般2-5分鐘），立即加入溫和酶使用量2倍體積（6mL）的細(xì)胞培養(yǎng)上清或者wan全培養(yǎng)基稀釋細(xì)胞懸液。

特別提示：

使用培養(yǎng)上清液或wan全培養(yǎng)基稀釋溫和消化酶（貨號：NC1004.1）對細(xì)胞有較好的保護(hù)作用，比使用DPBS等緩沖液會多

回收10～30%的細(xì)胞，而且培養(yǎng)上清液或wan全培養(yǎng)基能夠更好的保持細(xì)胞活性，能一直維持較高的擴(kuò)增倍數(shù)。

5. 用移液器輕輕吹打瓶壁上未wan全脫離的細(xì)胞，并輕輕吹打混勻，使細(xì)胞wan全分散。

特別提示：

進(jìn)行該操作時動作一定要溫和，因為細(xì)胞消化過程中的細(xì)胞損傷，更多的是來自于類似吹打與離心的機(jī)械損傷。

6. 將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到15 mL 離心管中，300g離心5 min。棄上清，加入2mLwan全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，使用臺盼藍(lán)染色，或流式細(xì)胞儀等方法計數(shù)。

7. T175瓶加入35mLwan全培養(yǎng)基。按密度8000 cells/cm2 接種細(xì)胞。

特別提示：

應(yīng)讓培養(yǎng)基沿培養(yǎng)瓶的上表面（細(xì)胞生長面的相對面）或側(cè)表面加入，切忌沖到培養(yǎng)瓶底面，否則容易在培養(yǎng)基沖刷到培養(yǎng)瓶底面位置出現(xiàn)細(xì)胞生長空白區(qū)域。

離心步驟不可去除，干細(xì)胞溫和消化酶短時間內(nèi)對細(xì)胞無損傷，但切勿超過10分鐘。

8. 將培養(yǎng)瓶置于37℃，5%CO2，飽和濕度條件下培養(yǎng)。